如何理解轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對工具STAR

如何理解轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對工具STAR，很多新手對此不是很清楚，為了幫助大家解決這個難題，下面小編將為大家詳細講解，有這方面需求的人可以來學(xué)習(xí)下，希望你能有所收獲。

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STAR是一款RNA_seq數(shù)據(jù)專用的比對軟件，比對速度非?？?，最大的優(yōu)勢是靈敏度高，GATK推薦采用STAR比對，然后進行下游的SNP分析。軟件的源代碼保存在github上，地址如下

https://github.com/alexdobin/STAR

安裝過程如下

wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.6.1b.tar.gz
tar xzvf 2.6.1b.tar.gz

解壓縮之后，在bin/Linux_x86_64_static目錄下，提供了編譯好的可執(zhí)行文件STAR。和hisat等軟件不同，STAR將所有的功能整合在了同一個程序中，通過切換runMode來執(zhí)行不同的任務(wù)。

1. 構(gòu)建基因組索引

運行比對前，首先需要對基因組建立索引，建立索引對應(yīng)的runMode為genomeGenerate, 基本用法如下

STAR --runMode genomeGenerate \
--runThreadN  20 \
--genomeFastaFiles hg19.fasta \
--genomeDir hg19_STAR_db \
--sjdbGTFfile hg19.gtf \
--sjdbOverhang  149

建立索引需要基因組的fasta和gtf文件，通過genomeFastaFiles和sjdbGTFfile這兩個參數(shù)分別指定；STAR構(gòu)建索引需要指定一個輸出目錄，這個目錄必須事先創(chuàng)建好，在該目錄下，會生成許多文件，所以必須有寫權(quán)限；runThreadN指定線程數(shù)；sjdbOverhang的值默認為100， 在實際設(shè)置時，最佳取值為max(read_length) - 1。

在構(gòu)建索引時，還支持加入intron的區(qū)間信息，通過sjdbFileChrStartEnd指定對應(yīng)的文件，多個文件用逗號分隔，這種格式的文件是由STAR比對產(chǎn)生的，通常用于2-pass比對模式。

官方推薦基因組的fasta采用primary_assembly版本, 不應(yīng)該包含alt_scaffold和patches。對于human而言，NCBI的鏈接如下

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/vertebrate_mammalian/Homo_sapiens/latest_assembly_versions/GCF_000001405.38_GRCh48.p12/GCF_000001405.38_GRCh48.p12_assembly_structure/Primary_Assembly/

Ensembl鏈接如下

ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh48.dna.primary_assembly.fa.gz

2. 運行比對

STAR支持fasta/fastq格式的輸入文件，如果序列文件是壓縮之后的，需要用readFilesCommand參數(shù)指定文件解壓縮的方法，對于gzip壓縮的文件而言，有以下兩種下寫法

--readFilesCommand  zcat
--readFilesCommand  gzip -c

比對完成后，會輸出許多文件，包含4個類別

  1. log文件

  2. sam文件

  3. bam文件

  4. 剪切位點文件

每個文件都有事先定義好的名字，當(dāng)多個樣本同時運行時，為了加以區(qū)分，可以通過outFileNamePrefix指定輸出文件的前綴。前3種類型的文件都比較容易理解，剪切位點文件實際上是根據(jù)mapping情況，估算出來的intron區(qū)間的信息，默認的文件名稱為SJ.out.tab。

默認輸出的比對文件為SAM格式，為了節(jié)省磁盤空間，方便下游分析，可以通過outSAMtype參數(shù)指定輸出bam文件，該參數(shù)有兩個字段值，第一個值指定文件類型， 取值有SAM和BAM兩種，第二個值指定是否排序，取值范圍包括Unsorted, SortedByCoordinate, 寫法如下

--outSAMtype BAM SortedByCoordinate

上述寫法輸出排序之后的bam文件。

單端數(shù)據(jù)比對的基本用法如下

STAR \
--runThreadN  20 \
--genomeDir hg19_STAR_db \
--readFilesIn reads.fq \
--sjdbGTFfile hg19.gtf \
--sjdbOverhang  149 \
--outFileNamePrefix sampleA \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate

雙端數(shù)據(jù)比對的基本用法如下

STAR  \
--runThreadN  20 \
--genomeDir hg19_STAR_db \
--readFilesIn r1.fq.gz r2.fq.gz \
--readFilesCommand  zcat \
--sjdbGTFfile hg19.gtf \
--sjdbOverhang  149 \
--outFileNamePrefix sampleA \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate

以上只是基本的比對，STAR官方更推薦使用2-pass比對模式，即比對兩次，有以下兩種方式

  1. multi-sample 2-pass
    第一次比對和上述的用法一致，比對完之后，每個樣本會產(chǎn)生一個intron的區(qū)間文件SJ.out.tab; 在第二次比對之前，重新構(gòu)建一次基因組的索引，添加所有樣本的SJ.out.tab文件，然后利用新的基因組索引重新比對。這種做法綜合了多個樣本的intron信息，比對的靈敏度會更高，缺點是操作比較繁瑣。

  2. per-sample 2-pass
    對于單個樣本，在比對時直接添加--twopassMode Basic參數(shù)，軟件會自動進行兩次比對，將第一次比對的SJ.out.tab加入到索引，然后重新比對。這種方法操作簡單，適用于單個樣本的2-pass 比對。

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本文來源：http://bm7419.com/article42/isghhc.html

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